본 발명은 폴리믹신 B 및 콜라게나아제를 이용한 췌도세포 분리방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 본 발명은 콜라게나아제(collagenase)를 이용한 췌도세포 분리 방법에 있어서, 상기 콜라게나아제 처리시 폴리믹신 B(polymixin B)를 추가로 처리하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 분리 방법에 관한 것이다. 본 발명의 췌도세포 분리방법은 콜라게나아제에 혼입되어 있는 엔도톡신의 작용을 저해함으로써 췌도세포의 피해를 막아주기 때문에 보다 효율적으로 췌도세포를 분리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 췌도세포 분리방법은 췌도세포 이식시 효과가 뛰어난 우수한 품질의 췌도세포를 제공할 수 있는 효과가 있다.